La venerata immagine della "Concezione" conservata nella cappella-santuario riproduce un'iconografia che presenta schemi consueti della pittura bizantina del sec. XIII. Si tratta di una pittura a tempera su tavola di legno che raffigura la Madonna con il Bambino in braccio. La superficie pittorica, molto ritoccata e forse in parte completamente ridipinta, rimanda nello stile a precisi canoni bizantini. Il tipo iconografico è quello della Madonna "Odighitria" (Colei che guida), ma in una variante di tipo sentimentale in quanto la Vergine ha il gesto affettuoso di avvicinare il suo volto a quello del Bambino che stringe a sè. Questo atteggiamento viene indicato con il termine di "Glykophilousa" (Colei che bacia dolcemente").
Ulteriori elementi bizantini della immagine di San Francesco sono le due stelle poste sul manto (una sulla fronte, l'altra sulla spalla sinistra), il "maforion" cuffia che raccoglie i capelli della Vergine sotto il velo e il motivo del bordo dello stesso a segmenti dorati.
L'immagine dipinta dell'Immacolata Concezione è entrata in San Francesco nel 1530 proveniente dal Monastero delle Clarisse. Collocata dapprima nella sala capitolare del convento l'immagine venne trasferita nel 1532 nella cappella appartenente alla famiglia dei Della Rovere già dedicata al culto dell'Immacolata.
La storia del culto per la venerata immagine segna alla metà del Cinquecento uno sviluppo ulteriore specialmente in momenti di calamità e pericoli come nel 1553 quando nei giorni 19, 20 e 21 giugno vennero ordinate tre processioni penitenziali con l'immagine della Concezione.
Fu istituita anche una confraternita per tutelarne il culto fin dal 1530, poi soppressa nel 1773 da Papa Clemente XIV, a causa di ripetuti contrasti avvenuti con la comunità francescana.